在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長波長的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個(gè)光子的能量相加達(dá)到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號(hào)。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡成像視野

雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、診斷和特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選鑒定、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù)，建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫，定義出針對(duì)不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。討論環(huán)節(jié)，來自病理科、呼吸中心、心臟科、神經(jīng)科、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結(jié)合各自的工作領(lǐng)域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任計(jì)劃再次邀請(qǐng)王愛民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。國外激光熒光雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對(duì)多種臟器的成像研究。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小。

2020年，臨研所、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無限制行為動(dòng)物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時(shí)病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn)，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。

雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力，該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系，還仍需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、診斷和特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選鑒定、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù)，建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫，定義出針對(duì)不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。討論環(huán)節(jié)，來自病理科、呼吸中心、心臟科、神經(jīng)科、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結(jié)合各自的工作領(lǐng)域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任計(jì)劃再次邀請(qǐng)王愛民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。通過本次學(xué)術(shù)交流，病理科與研究所分別與王愛民副教授課題組達(dá)成了初步的合作意向。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長波長的光子。布魯克雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡成像視野

雙光子技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷方面有著巨大的應(yīng)用潛力。這方面沒有標(biāo)準(zhǔn)和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究和龐大的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支撐。通過基于多光子成像技術(shù)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，可以發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、疾病的診斷和特征的關(guān)系。共同探索生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選皮膚病、自身免疫性疾病等疑難疾病的識(shí)別、診斷和鑒別診斷依據(jù)，建立全新完整的多光子細(xì)胞診斷數(shù)據(jù)庫，明確不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。在討論環(huán)節(jié)，來自病理科、呼吸中心、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、皮膚科、研究所的多位醫(yī)生和科研人員結(jié)合各自的工作領(lǐng)域，與王愛民副教授進(jìn)行了熱烈的討論。其中，毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任擬再次邀請(qǐng)王愛民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。通過此次學(xué)術(shù)交流，病理學(xué)系和研究所分別與王愛民副教授課題組達(dá)成了初步合作意向。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡成像視野