外泌體是由細(xì)胞分泌的包含 RNA 和蛋白質(zhì)的小囊泡（30～150 nm），它可將源自親代細(xì)胞的特定物質(zhì)遞送至疾病發(fā)展相關(guān)的受體細(xì)胞，因此一直被認(rèn)為可作為疾病進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物用于診斷，但具體機(jī)制仍不清楚。

外泌體RNA作為癌癥診斷標(biāo)志物是否可行

CircLPAR1 是外泌體中的環(huán)狀 RNA 分子，在結(jié)直腸癌（CRC）患者血漿外泌體中會(huì)發(fā)生顯著變化。南京醫(yī)科大學(xué)團(tuán)隊(duì)在 Molecular cancer 發(fā)文[1]，通過(guò)對(duì) CRC 特異性的外泌體 circRNA 進(jìn)行鑒定和富集，最后使用 qPCR 檢測(cè)后進(jìn)行功能評(píng)估。本研究對(duì)血漿外泌體 circLPAR1 可作為 CRC 高靈敏早期診斷標(biāo)志物提供了新的證據(jù)。

qPCR 檢測(cè)外泌體是強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手還是無(wú)稽之談？

我們也許會(huì)有疑問(wèn)：外泌體本來(lái)就少，提取的 RNA 就更少，后續(xù)做 qPCR 檢測(cè)豈不是難上加難？想知道 qPCR 檢測(cè)外泌體是否具有合理性，我們需要先了解如何進(jìn)行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

1）外泌體提取

包括 Umibio 在內(nèi)的很多公司都有針對(duì)各種不同樣本的外泌體提取試劑盒。樣本預(yù)處理階段很重要，甚至決定了后續(xù)提取外泌體的純度和量。

2）RNA 提取

外泌體 RNA可以用專(zhuān)用的外泌體 RNA 提取試劑盒提取，也可以用 Trizol 法提取，建議 Trizol 與外泌體的體積比不小于 4:1（也可以用 Trizol 直接裂解外泌體沉淀）。

具體操作：取 200 μl 外泌體于 1.5 ml EP 管中，加入 800 μl Trizol 試劑，充分混合，裂解 10 min，12000 rpm 離心 10 min 取上清。

3）反轉(zhuǎn)錄

采用 Umibio 4× 預(yù)混型快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：適用于長(zhǎng)片段 RNA（如 mRNA、LncRNA 等）、miRNA 加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒做反轉(zhuǎn)錄：適用于短片段 RNA（主要為 miRNA）的加尾法。

4）qPCR 檢測(cè)

采用 Umibio 2×SYBR Green qPCR 試劑：預(yù)混 ROX1 型適用于 ABI 5700 等設(shè)備、預(yù)混 ROX2 型適用于 ABI 7500 等設(shè)備。

5）數(shù)據(jù)分析：采用儀器自帶的 QPCR 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

可以看到 qPCR 檢測(cè)外泌體可行且可靠，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程并不簡(jiǎn)單，因此我們對(duì)經(jīng)常會(huì)遇到的問(wèn)題及解答也進(jìn)行了整理，幫助大家更好的完成實(shí)驗(yàn)。

qPCR檢測(cè)外泌常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

1. 外泌體 RNA 如何提??？

外泌體 RNA可以用專(zhuān)用的外泌體 RNA 提取試劑盒提取，也可以用 Trizol 法提取，建議 Trizol 與外泌體的體積比不小于 4:1（也可以用 Trizol 直接裂解外泌體沉淀）。

2. 外泌體 RNA 如何定量？

外泌體 RNA 含量很低，不建議使用微量紫外分光光度計(jì)定量，可以使用 Agilent 2100 生物分析儀等定量，也可以直接按最大體積進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

3. 外泌體做 qPCR 檢測(cè)應(yīng)該選什么參照？

外泌體沒(méi)有通用的內(nèi)參選擇，可以使用外參（cel-miR-39）作為參照。

4. 外泌體多樣本進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)有差異，是否正常？

一般來(lái)說(shuō)屬于正?，F(xiàn)象，由于外泌體不像細(xì)胞或者組織來(lái)源穩(wěn)定，不同外泌體樣本及處理的差異，可能導(dǎo)致外泌體里核酸含量及片段大小不同，會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(xiàn)或溶解曲線(xiàn)的差異。

5. 外泌體 qPCR 檢測(cè) CT 值較大是否正常？

屬于正常現(xiàn)象，由于外泌體 RNA 含量較低，特別是一些低豐度的基因 CT 值會(huì)較大，可以選擇高效的反轉(zhuǎn)錄及 PCR 試劑。

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qPCR 檢測(cè)外泌體實(shí)驗(yàn)中相關(guān)產(chǎn)品

4× 預(yù)混型快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

本試劑盒采用的 DNase 及 buffer 反應(yīng)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)特殊的優(yōu)化，需室溫（19～27℃）反應(yīng) 5 分鐘，就能降解 95% 以上的基因組 DNA，極大地降低了殘留基因組對(duì)結(jié)果的干擾。

新型 M-MLV 突變體逆轉(zhuǎn)錄酶具有很強(qiáng)的抗干擾能力及擴(kuò)增能力，15 分鐘得到的擴(kuò)增產(chǎn)物量可以達(dá)到 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶大約 1 小時(shí)的產(chǎn)物量（Ct 值相同）。后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物建議用于 PCR、qPCR，不建議用于基因克隆。

miRNA 加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

本試劑盒采用 Poly(A)加尾反應(yīng)和 cDNA 合成反應(yīng)同步進(jìn)行的方法來(lái)進(jìn)行 microRNA 第一鏈 cDNA 的合成，包含了與此配套的通用型 qPCR 反向引物（Universal 3’qPCR Primer），需自行設(shè)計(jì)一條目的 microRNA 的特異性正向引物，就能夠用于 microRNA 的定量檢測(cè)。

2×SYBR Green qPCR 試劑（預(yù)混 ROX1 型或預(yù)混 ROX2 型）

本試劑盒采用具有超強(qiáng)擴(kuò)增能力和抗干擾能力的熱啟動(dòng) DNA 聚合酶，結(jié)合其高度優(yōu)化的緩沖液體系和染料系統(tǒng)，使之具備更強(qiáng)的擴(kuò)增效率、抗干擾能力，更高的靈敏度和特異性。在相同的情況下具有起峰更早、得到的熒光信號(hào)更強(qiáng)、Ct 值更小及熔解曲線(xiàn)特異性更高等特點(diǎn)。此外，為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作，本試劑盒的 2×SYBR Green qPCR Master Mix 預(yù)混了 ROX1 染料（highROX）或預(yù)混了 ROX2 染料（low ROX），從而只需要將模板 cDNA、引物以及 ddH2O 添加進(jìn)去，即可進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Zheng, Rui et al. “Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3-eIF3h interaction.” Molecular cancer vol. 21,1 49. 14 Feb. 2022, doi:10.1186/s12943-021-01471-y